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            fitc熒光染料使用四大方法

            2017-09-03 15:44:02      點擊:

            fitc熒光染料使用四大方法:

            fitc熒光染料使用方法一:Marsshall法

            (1)材料    抗體球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol/LPBS等。

            (2)方法及步驟   

            ①抗體的準備  取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中,再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使最后免疫球蛋白濃度為20mg/ml,碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5~10min。
                 ②熒光素的準備  根據欲標記的蛋白質總量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg熒光色素,用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量,還可以算出需加緩沖液的量。
                 a.蛋白溶液:含量Amg/m1;容積Bml。
                 b.總蛋白量(AXB)=Crag。
                 c.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)。
                 d.熒光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。
                 e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸鹽緩沖液D/10=Fml。
                 f. PBS量D-(B+F)=Gml。

            注:A為蛋白含量,mg/ml;B為蛋白質溶液的容積;C為蛋白總量,mg;D為常數,mg;正為熒光素的量,mg;F為碳酸鹽緩沖液的容積,ml;G為PBS的容積,ml。
                 ③結合(或標記)  邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內加完),加完后,繼續避光攪拌12h左右。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右,故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
                 ④透析  結合完畢后,將標記的球蛋白溶液離心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,裝入透析袋中,再置于燒杯中,用pH8.0緩沖鹽水透析(0~4~C)過夜。
                、葸^柱  取透析過夜的標記物,通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱,分離游離熒光素,收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液:0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2);過濾量:12ml標記全球蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍左右)。

            fitc熒光染料使用方法二改良法

                (1)試劑和材料   

            ①0.01mol/L(pH7.2)PBS配法中,校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g,溶于2000ml蒸餾水
                、0.5mol/L(pH9.0)碳酸鹽緩沖液配法  取0.5mol/LNazCOs(5.3%)10ml加入0.5mol/LNaHC03(4.2%)90ml,混合后,校定pH至9.0。
                 ③3%碳酸鈉水溶液配法  稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
                 ④其他試劑和材料  l%疊氮化鈉、離心機及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m1)透析袋等。

            (2)方法及步驟   

            ①取高效價的抗人球蛋白兔免疫血清,分離球蛋白,用鹽水(0.15mol/LNaCl)及緩沖液(0.5mol/LNaHC03—Na2C03,pH9.0)稀釋使每毫升內含蛋白質lOmg,緩沖液為總量的10%,降溫至4℃。
                 ②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白:熒光素=(50—80)mg‘lmg],在0~4~C
            下電磁攪拌12~14h。
                、廴缓笥冒腼柡偷牧蛩徜@將標記球蛋白沉淀分離,除去未結合的熒光素,再用緩沖鹽水透析,除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗,至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。
                 ④將制備好的熒光抗體加疊氮化鈉o.01%,分裝在lml安瓿中,或凍干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,一20~C保存可達2年以上。

            fitc熒光染料使用方法三:Chadwick法

            (1)試劑和材料    抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯(25ml)攪拌器、無菌吸管,無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500ml)透析袋等。

            (2)方法及步驟   

             ①抗體準備  用o~4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30~40mg/ml,置入25ml燒杯內,放于冰槽中。
                 ②熒光色素準備  按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0.01rug計算,稱取所需的熒光素,用3%碳酸鈉水溶液溶解。
                、蹖蕚涞目贵w與熒光色素溶液等量混合,充分攪勻,在o~4~C冰箱中結合(最好在磁力攪拌機上持續攪拌)18~24h。

                 ④透析和柱層析  方法同Marsshall法。


            fitc熒光染料使用方法四:透析標記法

            此法適用于小量抗體的熒光素標記,標記簡便,非特異性染色較少。

            (1)試劑和材料   試劑和材料同改良法。

            (2)方法及步驟 

            ①用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0,將欲標記免疫球蛋白稀釋成1%濃度,裝入透析袋中。
             、谟猛痪彌_液將FITC配成0.1mg/ml的溶液,按10mg/ml球蛋白溶液體積的10倍,將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內,并使透析袋浸沒于FITC液中。
                ③容器頂端蓋緊,底部放攪拌棒,在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液,即刻用SephadexG50凝膠過濾,去除游離熒光素,分裝,貯存于4℃中。

            以上是fitc熒光染料使用四大方法,本文由昀輝科技整理發布

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